ການພັດທະນາ ແນວພັນເຂົ້າໃໝ່ ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມືທີ່ທັນສະໄໝ

ການທົດລອງ

ທັງ  2  ປະຊາກອນ  ຂອງ ILs  (Oryza sativa.  L) ໄດ້ພັດທະນາ.  ແນວພັນຕົວໃຫ້  ໃນ ຊຸດທຳອິດແມ່ນ HNN, ເຊິ່ງເປັນແນວພັນທີ່ມີ functional  nucleotide  polymorphism (FNP)ໃນ exon 7ຂອງ BADH2, ແລະ KNL 

ເປັນແນວພັນຕົວໃຫ້  ໃນຄູ່ທີ 2. ສຳລັບ  ທັງ 2ປະຊາກອນ,  ແນວພັນຕົວຮັບ  ແມ່ນ TSN1, ເປັນແນວພັນທີ່ມີຜົນຜະລິດສູງ  ແຕ່ບໍ່ຫອມ. ຄູ່ປະສົມທຳອິດ  ແມ່ນໄດ້ປະສົມໃນລະດູຝົນ 2006 ທີ່ສູນຄົ້ນຄວ້າເຂົ້າ  ແລະ  ພືດເສດຖະ ກິດ, ສະຖາບັນ ຄົ້ນຄວ້າ ກະສິກຳ ແລະ ປ່າໄມ້ແຫ່ງຊາດ,  ປະເທດລາວ  ແລະ  ຕໍ່ມາແມ່ນປະສົມພັນຄູ່ ທີ 2. ໃນແຕ່ລະລຸ້ນ,  ສາຍພັນລູກຈາກປະຊາກອນຄູ່ປະສົມ HNNໄດ້ມີການຄັດເລືອກ ໂດຍໃຊ້  BADH2 ເໝືອນຄັດເລືອກໃນເມື່ອກ່ອນ(Fitzgerald et  al.,  2008).  ສາຍພັນລູກ F1ແມ່ນສາຍພັນ heterozygous ແລະ  ຄັດເລືອກເອົາສາຍພັນທີ່ມີຄວາມຫອມ  ແລ້ວນຳສາຍພັນດັ່ງກ່າວ  ປະສົມພັນກັບຄູ່ແນວພັນ TSN1.  ຂະບວນການດັ່ງກ່າວ ແມ່ນເຮັດໄປຈົນຮອດ 4 ລຸ້ນ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ  ປ່ອຍໃຫ້ສາຍພັນລຸ້ນລູກ BC4 F1ປະ ສົມຕົວເອງເພື່ອໃຫ້ໄດ້ BC4 F2. ສາຍພັນລູກ ILs,  BC4 F2ຈຳນວນ 437 ສາຍພັນ  ປູກຢູ່ໃນ ລາວ  ໃນລະດູຝົນ 2009. ໃນຊ່ວງທຳອິດຂອງ ການແຕກກໍ,  ໄດ້ເກັບເອົາໃບຈາກແຕ່ລະສາຍພັນ  ເພື່ອມາສະກັດ DNA ແລະ  ເກັບກ່ຽວເມື່ອ ສຸກແກ່.

          ສຳລັບຊຸດຄູ່ປະສົມ  ຂອງ KNL ເປັນແນວພັນຕົວໃຫ້,  ສາຍພັນທີ່ມີຄວາມຫອມທີ່ໄດ້ຄັດເລືອກ  ດ້ວຍການທົດສອບດົມກິ່ນຫາສາຍພັນທີ່ມີຄວາມຫອມ  (sensory  test). 

          ການທົດສອບແມ່ນໃຊ້ໃບ 2  g ຕົ້ມໃນ KOH(1.7%, 10 ml)ເປັນເວລາ 10 ນາທີ.  KOHສາມາດເຮັດໃຫ້ສານ  2-acetly  1-pyrroline (2AP) ອອກກິ່ນ  (Juliano,  1985).  ປ່ອຍໃຫ້ ສາຍພັນລູກ BC4F1ປະສົມຕົວເອງ ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ BC4F2,  ສາຍພັນ BC4F2  ໄດ້ປູກໃນລະດູຝົນ 2009.  ໃນຊ່ວງທຳອິດ  ຂອງການແຕກກໍ,  ໄດ້ເກັບເອົາໃບ ຈາກແຕ່ລະສາຍພັນ  ເພື່ອມາສະ ກັດ DNAແລະ ເກັບກ່ຽວເມື່ອສຸກແກ່.

ການວິໄຈສານຄວາມຫອມ 2-acetyl-1-pyrroline (2AP)

             ສານຕົ້ນຕໍ  ຂອງຄວາມຫອມ  ແມ່ນ2AP, ສານດັ່ງກ່າວ ໄດ້ວິໄຈສາຍພັນລູກ BC4F2 ຂອງຄູ່ປະສົມ  KNL ເຊິ່ງນຳໃຊ້ໃບເຂົ້າສະກັດສານຄວາມຫອມໃນເຄື່ອງວັດແທກ gas  chromatographymass   spectrometry   (Agilent 6890N  gas  chromatograph  equipped  with a  5975N  mass  selective  detector). ສານ 2AP ຖືກສະກັດດ້ວຍການຕົ້ມໃບສົດ  1g ດ້ວຍນ້ຳບໍລິສຸດ  ໃນເວລາ  30  ນາທີ  ທີ່ອຸນຫະພູມ 85C.  ຫຼັງຈາກນັ້ນ  ໄດ້ນຳເອົາໃບອອກ  ໂດຍການໃສ່ dichloromethane  ແລະ sodium chloride. ສັ່ນໃຫ້ເຂົ້າກັນ  ປະມານ 1 ນາທີ. ຊັ້ນ organic,  ທີ່ບັນຈຸ 2AP,  ຕອງຜ່ານ anhydrous  sodium  sulfate ແລະ  ເຮັດໃຫ້ເຂັ້ມຂຸ້ນດ້ວຍໄນໂຕຣເຈນແຫຼວ.  ຂະບວນການ  ແລະ ເງື່ອນໄຂຂອງ GC-MSແລະ ການສະກັດ 2APແມ່ນເໝືອນກັນກັບທີ່ໄດ້ອະທິບາຍ (Kovach et al., 2009). 

ການຄັດເລືອກສາຍພັນບໍລິສຸດ NILs

ສ່ວນນຶ່ງຂອງແຕ່ລะປະຊາກອນ BC4F2ໄດ້ນຳມາຄັດເລືອກດ້ວຍ  SNP  ບົນພື້ນຖານການ genotype ແລະ phenotype ຂອງຄວາມຫອມ  ແລະ  ຄັດເລືອກຕົ້ນ  ທີ່ມີລັກສະນະຄ້າຍຄື  TSN1.  ສາຍພັນ  BC4F2ຈຳນວນ  46 ສາຍພັນທີ່ມີ allele ຄວາມຫອມຈາກ HNN ແລະ  ອີກ 45 ສາຍພັນ  ທີ່ບໍ່ມີຄວາມຫອມ.  ສຳລັບຄູ່ປະສົມ KNL,  ນຳໃຊ້ SNP ເພື່ອຄັດເລືອກໄດ້   BC4F2ຈຳນວນ 34 ສາຍພັນ  ເຊິ່ງມີຄວາມຫອມທີ່ໄດ້ຈາກການສະ 

ກັດດ້ວຍເຄື່ອງ  GCMS.  DNA ໄດ້ສະກັດຈາກໃບຂອງທຸກໆຕົວຢ່າງ,  ເຊິ່ງວິທີການ  ແມ່ນໄດ້ອະທິບາຍກ່ອນໃນ  (Fulton et  al.,  1995). DNAໄດ້ສະກັດໃນປະລິມານ 50 ng/ul ນຳໃຊ້ Nanodrop  1000  (Wilmington,  DE,  USA). Genotyping ໄດ້ນຳໃຊ້ SNP ທີ່ 384  loci ນຳໃຊ້ Illumina  BeadXpress  GoldenGate Genotyping Assay (San Diego, CA, USA). SNP ໄດ້ວິໄຈນຳໃຊ້  Alchemy  software (Wright et  al.,  2010). ສັດສ່ວນຂອງ donor introgression ໃນທຸກສາຍພັນ  ໄດ້ກຳນົດດ້ວຍການໃຊ້ GGT  2.0:  Graphical  GenoTyping (van Berloo, 2008)

ການສະກັດສານລະເຫີຍ  (volatile  compounds) ໃນສາຍພັນທີ່ໄດ້ຄັດເລືອກ

ສາຍພັນທີ່ ຄັດເລືອກໄປສະກັດແມ່ນມີຄວາມຫອມ  ແລະ  ມີລັກສະນະຂອງຕົວໃຫ້ນ້ອຍທີ່ສຸດ. ໄດ້ຄັດເລືອກເອົາ 5ສາຍພັນ ຈາກຄູ່ປະສົມ HNNແລະ 6ສາຍພັນ ຈາກຄູ່ປະສົມ KNL. ຕົວຢ່າງເຫຼົ່ານັ້ນ ແມ່ນປູກຢູ່ລາວເພີ່ມອີກ 2 ລະດູການ  ເພື່ອເພີ່ມເມັດພັນ.  ເມັດສາຍພັນ 11 ສາຍພັນ  ດັ່ງກ່າວ BC4F4ໄດ້ເກັບກ່ຽວ ແລະ ສົ່ງໄປ ສະຖາບັນ ຄົ້ນຄວ້າ ເຂົ້ານາໆຊາດ (International  Rice  Research  Institute). ເຂົ້າເປືອກ  ໄດ້ແກະເປືອກດ້ວຍ  (THU35A 250V  50Hz  Test  Husker,  Satake) ແລະຂັດດ້ວຍ (Grainman 60-230-60-2AT, Grain 

Machinery  Mfg.  Corp.). ເຂົ້າສານຂອງແຕ່ລະສາຍພັນ  ແລະ  ພໍ່ແມ່ພັນໄດ້ສົ່ງໄປ Plant Research  International  Wageningen, The  Netherlands ເພື່ອວິໄຈຫາສານລະເຫີຍ (volatile compounds). ວິທີການທັງໝົດ ແມ່ນ ທາງຫ້ອງທົດລອງປະເທດດັ່ ງກ່ າວເປັນຜູ້ເຮັດທຸກຢ່າງ ພຽງແຕ່ສົ່ງຂໍ້ມູນມາໃຫ້.

ການພັດທະນາປະຊາກອນ

ຕາຕະລາງ 1 ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ  ຈຳນວນຕົ້ນທີ່ປະສົມ,  ຈຳນວນເມັດທີ່ປູກ  ແລະ ຈຳນວນເມັດທີ່ເກັບໄດ້ຂອງທັງ 2ຄູ່ປະສົມ. ສຳລັບຄູ່ປະສົມ KNL, ສາຍພັນ  BC4F2 ຈຳນວນ 34 ສາຍພັນ  ໄດ້ຄັດເລືອກດ້ວຍການດົມກິ່ນ 

(sensory test) ແລະ ວິໄຈດ້ວຍ GCເພື່ອເລືອກເອົາສາຍພັນຫອມ.  ສຳລັບຄູ່ປະສົມ  HNN,ສາຍພັນ BC4F2 ຈຳນວນ 77 ສາຍພັນ  ໄດ້ມີ ຄວາມຫອມ  ແລະ  ມີ gene ຄວາມຫອມ  ແລະ ສ່ວນທີ່ບໍ່ຫອມ ກໍຄັດເລືອກເອົາ. 

ຕາຕະລາງ 2 ສະແດງໃຫ້ເຫັນປະລິມານຂອງຄວາມຫອມຂອງແຕ່ ລະສາຍພັນ BC4F2ຂອງຄູ່ປະສົມ KNL ດ້ວຍການດົມ.  ຂໍ້ ມູນທີ່ໄດ້ສະແດງ ແມ່ນຈັດລຳດັບຈາກຄວາມ ຫອມຫຼາຍຫາຫອມໜ້ອຍ,  ທັງໝົດທຸກສາຍພັນທີ່ຄັດເລືອກແມ່ນມີຄວາມຫອມ. ເຕັກນິກ SNP (SNP profiling)

ຮູບສະແດງ  1 ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ SNP  profile ຂອງສາຍພັນ   BC4F2 ທີ່ໄດ້ຄັດ ເລືອກຂອງຄູ່ປະສົມ  HNN, ທຳອິດແມ່ນຄັດເລືອກຄວາມຫອມ  ດ້ວຍວິທີກວດສອບທາງພັນທຸກຳຂອງ gene ຄວາມຫອມ   chromosome 8, ແລະ  ຕໍ່ມາແມ່ນເບິ່ງເປີເຊັນການຄ້າຍຄືກັບ HNN.  ຮູບສະແດງ  2 ສະແດງໃຫ້ເຫັນແຜນທີ